(技术贴）肿瘤细胞侵袭实验

2015-12-08 小邦细胞之邦

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实验简介

肿瘤细胞侵袭能力检测在肿瘤学（迁移、侵袭）和免疫学（迁移、趋化）中是常规实验。

1.侵袭是细胞迁移的一种。细胞迁移分三种类型：趋触、趋化和侵袭。

2.肿瘤细胞的侵袭性是肿瘤相关信号通路、药物治疗、靶向治疗、致癌/抑癌基因等肿瘤学研究的一个重要指标。

3.免疫细胞具有趋化性，例如粒细胞、巨噬细胞、单核细胞对CCL、CXCL类因子的趋化性，免疫细胞异常（如过度趋化）通常会引起一些炎症类疾病如风湿、关节炎、牛皮藓、动脉粥样化等。

具体操作

以配合24孔板的8μM PET膜Millicell 悬挂式细胞培养小室（cat#MCEP24H48）为例，实验周期：3-5天

1.复苏代数靠前的肿瘤细胞，在含有10% FBS的培养基中预先培养2-3代，待细胞汇合达到80%左右，饥饿处理18-24小时。

2.准备铺胶：

a) 4 °C溶EMC胶过夜。

b) 将细胞小室、培养板和枪头等于4°C 预冷。

c)用无血清的冷培养基稀释ECM胶至20ug/mL，以5-10ug/cm2的密度加入到细胞小室的上层（按照ECM产品说明书的推荐比例和体积），轻轻摇晃使胶均匀铺在膜上。以上操作在冰上进行。

d)立即将铺好ECM胶的细胞小室置于培养板中，于37℃孵育1小时，ECM胶可由液体凝成固体，吸走多余的或者未凝的胶。

3.细胞用PBS清洗一次，EDTA或者0.05%胰酶消化，然后用包含5% BSA的无血清培养基中和，1500rpm离心5-10min。

4.用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度至0.5-2.0 x106cell/ml。

5.取上述200μL细胞液加入小室，下室（培养板）加入900L含有10% FBS的培养基。不同规格的小室和培养板所加的体积不同，具体参考Millicell R 产品说明书以配合24孔板的8μM PET膜Millicell 悬挂式细胞培养小室（cat#MCEP24H48）为例，实验周期：3-5天

6. 37 ℃孵育24至72小时，依据肿瘤细胞类型而定。

7.孵育结束，小心取出细胞小室，吸掉小室上层培养液，PBS清洗一遍，70%酒精或者4%多聚甲醛固定5min，0.5%结晶紫（2%乙醇或PBS溶解）染色 20min，然后进行第8步或者第9步。

8. PBS清洗两次以去除多余的染料，立即用棉签擦去滤膜上层的细胞，自然静置风干。显微镜下观察滤膜下层的细胞，随机选取不同的视野计数并算平均值。

9. 结晶紫溶解滤膜下层细胞，然后用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570 nm读取OD值。这种方法可以避免视野下细。